干货分享|Trizol法抽提细胞内总RNA

时间:2023-11-21 10:35:53  热度:0°C

试验材料:细胞(5× 105/每管×35),每人2管×15;

试验试剂和耗材:Trizol(1瓶)/***仿(1瓶)、异丙醇(1瓶)、***(1瓶)、DEPC水(1瓶)、RNA-freeEP管(一袋)、EP管架(15个);

试验仪器设备:低温离心机(1~2台),***(1ml、200μl、10 μl)×15套,通风橱(1~2台),NanoDrop微量紫外-可见光分光光度计

1,细胞用50~100 μlPBS重悬后,加入1 ml Trizol (一般1×107细胞加入1 ml左右的Trizol)/ 按照1/5的比例加入200 μl***仿,用力震荡30秒后室温静置,使其裂解充分(3~5 min);

2,离心15 min × 12000 rpm,4℃;

3,吸上清至新的离心管(小心勿吸到中间层的DNA,宁可损失一点),加和上清等体积的异丙醇,温和的上下颠倒数次混匀,室温放置10min后离心10 min × 12000 rpm,4℃;

4,弃上清,加1 ml RNase-free 75%乙醇,离心5min × 12000rpm,4℃;

5,倒掉乙醇,2 min × 12000 rpm,4℃,用RNase-free的***头吸掉上清;

6,之后在通风橱吹干(大风3~5 min),使酒精完全挥发(酒精会严重影响酶的活性);

7,加入30~50 μl RNase-free H2O,反复吹打、混匀、充分溶解RNA,用RNase-free H2O稀释(80倍左右)测OD值。测定样本在260nm和280 nm的吸收值确定RNA的质量,1OD= 40 μg RNA来计算RNA浓度/ OD260/280在1/8~2/0之间确定RNA样本纯度很高。

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